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 本刊论文 |
| 缺氧诱导因子—1α在百草枯中毒大鼠肝脏的观察效果分析 |
| 作者：熊莺 时间：2016/09/27 点击：461 |
百草枯（paraquat，PQ）是广泛使用的有机杂环类接触性除草剂，对人畜均有较强的毒性，急性PQ中毒致死剂量小，病程进展快，且临床上缺乏有效解毒剂，中毒后病死率高达80%以上，已成为严重威胁人们健康的重大问题。PQ中毒后在体内主要作用于肺组织，重度中毒的患者常出现急性肝功能障碍。目前PQ中毒导致肝脏损伤的具体机制尚不十分清楚。缺氧诱导因子（HIF）是一种常氧条件下基本不表达，缺氧时高表达且能够介导哺乳动物细胞低氧反应的核转录因子，其中HIF-1α是HIF-1所特有，是HIF-1的调节亚基，又是HIF-1的活性亚基。前期研究已证明HIF-1α在PQ所致急性肺损伤早期即出现表达升高，且可能参与了肺损伤早期的肺纤维化过程[1-2]。本研究通过检测PQ中毒后不同时间点大鼠血清转氨酶水平和肝组织中HIF-1α蛋白及TGF-β蛋白表达的变化，观察肝脏组织结构的变化，以探讨HIF-1α与PQ中毒后肝损伤的相关性。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作及标本采集
健康清洁级成年Spragne-Dawley（SD）雄性大鼠48只，体质量（250±30）g，由中科院上海实验中心提供，动物合格证号[SCSK（沪）2007-0005]，实验地点为上海市第一人民医院动物实验中心，在温度（23.0±0.5）℃，相对湿度45%～65%，每日光照12 h，自由摄食饮水的条件下饲养1周。将48只大鼠随机（随机数字法）分为正常对照组（6只）：生理盐水1 mL一次性灌胃，；PQ染毒组（42只）：按50 mg/kg将20%PQ（英国先正达有限公司生产）用生理盐水稀释至1 mL一次性灌胃染毒，染毒组按灌胃后2、6、12、24、48、72及120 h分为7个亚组，每组6只。剔除中毒症状不明显及死亡的动物，以染毒大鼠出现食欲下降、反应迟钝、毛蓬松、鼠尾发绀、呼吸困难、不能支持体重、易捕捉等标准[3]选择染毒组模型动物。最后造模成功的大鼠分组情况为染毒2、6 h组各6只大鼠；染毒12、24、48、72及120 h组各5只大鼠；染毒120 h组3只大鼠。灌胃后分别于2、6、12、24、48、72及120 h腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，腹主动脉取血备检动脉血气、血乳酸及生化肝功能指标；处死动物取肝组织行HE染色和Masson染色进行病理学观察，制备肝组织匀浆行蛋白免疫印迹法（Western blot）检测HIF-1α和转化生长因子-β（TGF-β）的表达变化，相同实验重复3次。
1.2 血气及血乳酸测定
动脉血气的氧分压和乳酸采用美国雅培i-STAT公司床边临床血液分析系统300型，试剂采用CG4+硅芯片。
1.3 血肝功能测定
腹主动脉取动脉血离心后留血清，送上海市第一人民医院急诊检验科测定血清丙氨酸氨基转氨酶和天冬氨酸氨基转移酶水平。
1.4 肝组织的病理学观察
取5 mm厚度肝组织甲醛固定，石蜡包埋，切成约5 μm切片，行HE染色和Masson染色，光学显微镜观察肾组织病理改[第一论文网www.dylw.net专业提供论文代写和代写论文服务，欢迎您的光临]变，AxioVision 3.0软件拍摄照片。
1.5 肝组织HIF1-α蛋白和TGF-β蛋白水平表达的Western blot检测
提取组织总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度。每个加样孔加入50 μg样品，于8%分离胶进行电泳，冰上转膜（120 V）2 h，室温封闭1 h后，加入美国Abcam公司兔抗HIF-1α（1∶1500）、美国Abcam公司兔抗TGF-β（1∶2000）4 ℃孵育过夜。洗膜后加入羊抗兔二抗（1∶1000）常温孵育1 h。洗膜后用增强化学发光法显色、显影，曝光KODAK胶片5～10 min。
1.6 统计学方法
所有数据均采用SPSS 15.0软件包进行统计分析。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，两组之间比较采用Dunnet-t检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 染毒大鼠不同时间血气及乳酸测定
6 h染毒组大鼠血乳酸开始明显升高，6、12、24、48、72、120 h染毒组大鼠与对照组比较差异具有统计学意义（P<0.05），2、6、12、24、48 h染毒组大鼠均未出现低氧血症；72 h、120 h染毒组大鼠出现低氧血症，PaO2明显低于对照组，差异具有统计学意义（P<0.05）。见表1。
2.2 染毒大鼠不同时间肝功能改变
染毒组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）及天冬氨酸氨基转移酶（AST）中毒后2 h开始上升，2、6、12、24、48、72、120 h染毒组与对照组比较，差异具有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.3 肝脏组织HE染色
对照组大鼠肝组织细胞大小一致，细胞排列呈条索状，以中央静脉为中心呈放射状，肝窦无狭窄，小叶及汇管区无炎细胞浸润；染毒后2 h开始镜下见汇管区周围部分肝细胞变性、坏死，汇管区少量炎症细胞浸润；至染毒后12 h汇管区进一步扩大，伴大量炎性细胞浸润，并出现纤维条索样增生；48 h出现大量肝细胞崩解坏死，纤维组织增生；至120 h肝细胞坏死区已延伸至中央静脉周边，肝细胞气球样变性，见图1。
2.4 肝脏组织Masson染色
Masson染色可见胶原纤维被染成蓝色。染毒后2 h汇管区扩大，蓝染的胶原纤维增多，随着时间的延长，汇管区扩[第一论文网www.dylw.net专业提供论文代写和代写论文服务，欢迎您的光临]大明显，蓝染的胶原纤维逐渐增多，并由汇管区逐渐向中央静脉周边延伸，见图2。
2.5 肝组织HIF1-α蛋白和TGF-β蛋白水平表达
染毒后2 h开始大鼠肝脏组织的HIF-1α和TGF-β的表达明显升高，染毒组2、6、12、24、48、72及120 h各时间点HIF-1α蛋白表达与对照组的差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05），见图3，图4。
3 讨论
PQ中毒后导致急性肺损伤继发多脏器功能障碍和肺间质纤维化是主要的死亡原因。Podprasart等[4]研究结果表明，百草枯在肝脏的含量约占肺组织含量的8%；可能与肝脏缺乏转运百草枯的转运蛋白及可以通过胆汁排泄有关。张兴国等[5]在119例百草枯中的患者中发现中毒后患者均有不同程度的肝功能损伤，以ALT和AST升高为主，且死亡组的ALT和AST明显高于存活组。Chin-Jung Yang等[6]在187例临床百草枯中的患者中发现年轻的患者更容易发生中毒性肝炎，且发生中毒性肝炎的患者更容易合并ARDS及急性肾损伤。肝脏是机体的主要代谢器官，具有双重血液供应，即肝固有动脉和门静脉。由于其血流的特殊性，形成了肝内氧分压呈梯度代谢现象，因此肝脏对缺氧损害极为敏感。血流从门静脉Ⅰ区到中央静脉沿着肝窦细胞的耗氧代谢过程中形成了明显的氧分压梯度。肝脏Ⅰ区优先获得血液供应和氧的供应，该区肝细胞代谢活跃；而Ⅲ区肝细胞接触营养物质较少，氧供不如I区，易遭受中毒损害。传统观点认为，肝纤维化是各种慢性肝病（包括病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、非酒精性脂肪肝、胆汁淤积性肝病）发展的共同途径，而肝脏受损及继发炎症时均伴有缺氧现象：如肝细胞肿胀，肝血管收缩，肝窦狭窄，肝窦毛细血管化，肝窦间隙纤维型胶原沉积，肝细胞再生结节、纤维间隔形成，肝内血管网异常，以及肝功能受损、肠源性内毒素所致内皮素产生增多等均可导致或加重肝内缺氧，使组织缺氧贯穿肝纤维化发生发展的整个过程在常氧条件下。1981年，Mullick等[7]在13例因百草枯中毒死亡的患者尸检时发现有10例存在中央小叶区的胆汁淤积。同时Mullick还认为百草枯导致的肝损伤存在二相性：早期为肝细胞的损伤，后期则为胆管细胞的损伤。Dinis-Oliveira等[8]则在尸检中发现了中央静脉的阻塞和门静脉周围肝细胞的坏死和纤维化的发生。
本实验中显示PQ中毒后大鼠2 h开始即有ALT和AST的明显升高，而ALT和AST是肝细胞损伤较为敏感的指标。镜下病理表现为肝细胞的水肿、坏死，炎症细胞的浸润，这些肝脏损害的表现均早于低氧血症的发生。肝细胞的坏死最先开始于汇管区并随着时间的延长逐渐扩展至中央静脉区，提示中毒后的肝损伤是随着血流的方向逐渐扩展，可能与PQ分子的直接毒性作用相关，同时汇管区是肝中毒后应激反应最敏感、最先发生的区域。伴随着肝细胞的水肿、空泡样变性、崩解及坏死，Masson染色中显示汇管区逐渐扩大，间质开始出现纤维化表现，并随着时间的延长，纤维化表现向中央静脉区延伸。临床上，也有部分患者在肺部症状出现之前就表现为严重的肝功能损害、凝血功能障碍，甚至暴发大出血死亡。本实验结果符合既往临床研究和实验研究结果，提示PQ中毒致肝损伤在中毒早期低氧血症发生前即可产生，如不加干预治疗，可能导致肝功能的进一步恶化和早期肝纤维化的发生，并更易合并肾损伤和ARDS。
HIF-1是缺氧时人体调节内环境稳态的重要转录因子，它参与了几乎所有缺氧时的快速基因反应，包括无氧代谢、免疫反应、细胞因子产生、血管重建和全身内环境的稳态。传统观点认为缺氧是HIF-1α表达及经典刺激因素，然而近年来的研究表明在常氧条件下，HIF也可被激活，并引起炎症反应[9]。Tzouvelekis等[10]曾通过Meta分析证实HIF-1α基因的过表达在肺纤维化过程中有统计学意义，而敲除HIF-1α基因则能减轻小鼠肝纤维化的程度[11]。HIF-1α在肝脏是中等程度的表达，陈韶华等[12]用酒精灌胃建立酒精性肝病动物模型，发现HIF-1α表达明显增高。同时有研究发现随着肝脏病变加重，肝组织HIF-1α mRNA和蛋白表达水平增加。冯珍等[13]利用四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型，发现与对照组（肝纤维化S0级）比较，模型组（肝纤维化[第一论文网www.dylw.net专业提供论文代写和代写论文服务，欢迎您的光临]S2、S3、S4级） HIF-1α与HIF-1α的mRNA均明显增强，且与肝纤维化程度成正相关。HIF-1α在肝脏炎症、酒精性肝病、肝硬化、肝癌中的作用近年来也已有报道，其主要是通过对靶基因EPO、VEGF、诱导型N0合酶、糖酵解酶、葡萄糖载体蛋白1、3等表达的调节来参与作用的。迄今发现的HIF-1直接作用的下游因子有40多个[14-15]，其中包括TGF-β。TGF-β是公认的致纤维化的重要细胞因子。Suzuki等[16]国外较多研究报道TGF-β是通过HIF-1α途径表达的，也有报道HIF-1α是通过TGF-β调节表达的。本实验中笔者发现中毒后2 h开始大鼠肝脏组织的HIF-1α和TGF-β的表达均明显升高，染毒组2、6、12、24、48、72及120 h各时间点蛋白表达与对照组的差异具有统计学意义。从本实验结果笔者认为百草枯中毒后导致肝脏炎症反应，肝组织缺氧，引起HIF-1α表达的上调，进而促进了TGF-β基因的转录，促进了肝纤维化的发生发展。肝纤维化存在复杂的细胞因子网路调控，HIF-1α调控TGF-β的表达的具体机制，尚值得进一步探索，有待于我们进行更多的研究。 |
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